Мабуть, немає жодної людини в нашій країни, життя якою не зачепила сумнозвісна коронавірусна хвороба або, як її офіційно називають, COVID-19. Новинні стрічки кожного дня поновлюються десятками повідомлень щодо карантину, обмежень, рішень влади, статистики захворілих і т.д. І не так часто з’являються новини, які стосуються медичної сторони діагностики і боротьби із цим вірусом. Можливо, через те, що такі новини не цікаві або складні для розуміння.
На щастя, студенти-біотехнологи нашої кафедри належать до іншої групи людей. Завдяки вивченню таких дисциплін, як «Основи імунології», «Генетика», «Загальна мікробіологія і вірусологія», «Молекулярна біотехнологія» вони цікавляться не тільки наслідками пандемії, але й науковими статтями, в яких йдеться про особливості діагностики та лікування COVID-19.
Нове коронавірусне захворювання викликає вірус SARS-CoV-2, який належить до роду Betacoronavirus. В історії з епідемією коронавірусу залишається безліч невідомих. І не менше питань, ніж сам вірус, у людей викликають тести, за допомогою яких його пропонується виявляти.
Симптоми, що притаманні пацієнтам з COVID-19, неспецифічні і не можуть бути використані для точного діагнозу. Тому захворювання можливо точно ідентифікувати лише за допомогою молекулярних методів. Головні складнощі під час виявлення збудників інфекцій полягають в тому, що вони дуже маленькі. Для того, щоб виявити вірус, необхідно отримати його велику кількість. Якщо сказати точно, то збільшують кількість копій не самого вірусу, а його генетичного матеріалу. Для цього використовують метод полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). SARS-CoV-2 є вірусом з одноланцюговою (+)РНК. А метод ПЛР передбачає отримання великої кількості копій саме ДНК. У зв’язку з цим, молекулярні біологи використовують фермент зворотну транскриптазу, який синтезує ДНК на матриці РНК. Після цього починається ПЛР. Кожен цикл ланцюгової реакції складається з трьох етапів:
1. Денатурація: реакційну суміш нагрівають (94-96 °С) і дволанцюгова ДНК розділяється на окремі ланцюги.
2. Відпал: розчин охолоджують (65 °С), затравки-праймери взаємодіють із відповідними ділянками ДНК.
3. Елонгація: суміш підігрівають (72 °С), полімераза починає працювати – розпізнає праймери і, починаючи з них, добудовує другий ланцюг ДНК.
Далі цикл повторюється. В суміш для ПЛР відразу додають флуоресцентний барвник, який взаємодіє з ДНК, а прилад з кожним циклом вимірює інтенсивність світіння. Саме через це метод називають «ПЛР в реальному часі».
Звідки беруться праймери для ПЛР-тесту для визначення SARS-CoV-2? Їх розробкою в світі паралельно займалися десятки лабораторій. Саме по собі це не дуже складне заняття: для розробки праймерів необхідно мати повністю розшифрований вірусний геном. Інформація про нуклеотидну послідовність SARS-CoV-2 з’явилася в мережі вже 10 січня 2020 року, після чого будь-який фахівець міг зайнятися пошуком унікальної саме для цього вірусу нуклеотидної послідовності. Далі до неї треба було підібрати відповідний праймер-затравку і перевірити, що він стабільний і взаємодіє з ДНК при температурах, яких досягає реакційна суміш в ході ПЛР.
Вченими було знайдено дві консервативні послідовності у РНК-геномі нового коронавірусу, на основі яких можна розробити праймери: ген N і ген Orf1b. Перший є спільним для різних споріднених коронавірусів, а другий – лише для SARS-CoV-2. На основі таких даних було розроблено дві тест-системи: одна – для універсального виявлення різних коронавірусів, включаючи SARS-CoV-2, а друга – для виявлення лише SARS-CoV-2. Таким чином, ПЛР N гена рекомендується використовувати як скринінговий аналіз, а аналіз Orf1b – як підтверджуючий. Зазвичай, у ситуаціях з N-позитивним/Orf1b-негативним результатом тесту для підтвердження діагнозу знадобиться тестування на антитіла до SARS-CoV-2.
ПЛР в реальному часі – надійний метод, придатний для виявлення будь-яких вірусів. Його ефективність не викликає сумнівів, проте необхідно розуміти, що і в нього є свої обмеження. І головне – це час. Дві основні хімічні реакції – зворотна транскрипція і ПЛР – займають близько години кожна. Значить, на те, щоб визначити, чи є в пробі коронавірус чи ні, необхідно ніяк не менше двох годин. Це, не враховуючи витрат часу на забір проби (найчастіше це мазок з верхніх дихальних шляхів), і підготовку реакцій.
У методу ПЛР є свої обмеження і за чутливістю: можливий негативний результат тесту при наявності у пробі малої кількості вірусних часток. Втім, не зважаючи на це, за точністю і ефективністю, на даний момент, ПЛР не поступається жодному з відомих діагностичних методів.
Ми в черговий раз закликаємо усіх бути особливо пильними і дотримуватися правил особистої гігієни. Будьте здоровими і не хворійте!
